Niðurstreymis ofsíun/þverunarsíun styrkingarferli: Hvernig á að koma í veg fyrir gegndræpi og tap markpróteina á áhrifaríkan hátt

Niðurstraums ofsíunar-/dreifingarstyrksferli: Hvernig á að koma í veg fyrir gegndræpi og tap markpróteina á áhrifaríkan hátt

Í niðurstreymishreinsunarferlum fyrir raðbrigða prótein, blóðafurðir og önnur líffræðileg efni, er ofursíun/díusíun (UF/DF) notuð til að styrkja hráefni, skiptast á stuðpúða og fjarlægja sölt og lítil-sameindaóhreinindi. Aðskilnaður næst á grundvelli himnusigtunar: stórar sameindir eins og einstofna mótefni (mAbs) haldast í himnunni, á meðan sölt, endotoxín, frjáls hýsilfrumuprótein (HCP) og önnur lítil-sameindaóhreinindi fara í gegnum himnuna og eru fjarlægð í gegndrættinum. Meðan á ferli skala-upp getur markprótein tap í gegnum himnuna auðveldlega átt sér stað, sem dregur beint úr ávöxtun og eykur lotukostnað. Við sumar notkunaraðstæður getur prótein greinst í gegndreypinu, sem krefst þess að fljótt sé ákvarðað hvort efnisþættirnir sem lekið eru séu ósnortið mark-mAb, niðurbrotið/brotið samsafn eða hýsilfrumuprótein. Þessi grein skiptist í tvo meginhluta: hún fer yfir hefðbundnar ferli-stýringaraðferðir og, ásamt Design of Experiments (DOE), kemur á fót öflugum ferliglugga, studdur af mörgum greiningaraðferðum til að ákvarða auðkenni próteina sem greinast í gegndrættinum.

 

 

I. Helstu orsakir fyrir gegndræpi markpróteina í gegnum himnuna meðan á UF/DF stendur

1. Of mikill yfirhimnuþrýstingur (TMP)
Þegar þrýstingsmunurinn yfir himnuna er of mikill, eykst viðnám leysiefna, sem neyðir einliða prótein inn í gegndreypið. Við uppsöfnun- inniheldur fóðurtankurinn meira magn af efni og þrýstingssveiflur í leiðslum eru áberandi, sem gerir tímabundinn yfirþrýsting líklegri en á rannsóknarstofukvarða.

2. Óviðeigandi snertiflæði
Ef flæðihraði er of lágt myndast þétt styrkleiki-skautun á yfirborði himnunnar og staðbundinn próteinstyrkur getur farið yfir þolmörk himnunnar. Ef flæðihraðinn er of hár getur klippiálagið valdið burðarvirkum klofningi á mAb, sem myndar smærri próteinbrot sem geta farið frjálslega í gegnum himnuholurnar.

3. Of hár próteinstyrkur í hráefninu
Þegar próteinstyrkur fóðursins er of hár safnast prótein upp á yfirborð himnunnar og eitthvað einliða prótein getur borist inn í gegndreypið. Þetta er algengt vandamál í stór-framleiðslu.

4. pH eða leiðni utan ferlisviðsins
Breytingar á hleðslueiginleikum próteinsins geta dregið úr vökvaradíus þess og sýnilegri kornastærð, sem leiðir til óeðlilegrar himnu gegndræpis.

5. Öldrun himnusnælda, mikið dreifandi flæði eða ófullnægjandi for-formeðferð
Líkamlegir gallar í himnuhylkinu geta beint valdið próteinleka og táknað -búnað tengda áhættu. Endurtekin CIP með sterk basískum lausnum getur smám saman skemmt pólýetersúlfón (PES) himnuefnið.

6. Of mikið síunarrúmmál
Meðan á langvarandi síun stendur getur samfelld skolun leysis smám saman borið í burtu lítið magn af einliða próteini.

 

II. Hefðbundnar hagnýtar ráðstafanir til að koma í veg fyrir gegndræpi og tapi markpróteina

(A) Stýring á færibreytum ferli

1. Stjórna yfirhimnuþrýstingi (TMP)
Skilgreindu efri viðvörunarmörk fyrir þrýsting og settu á samlæsingu til að koma í veg fyrir tímabundin háþrýstingsáhrif á himnulagið. Eftir að hafa ákvarðað grunnlínufæribreytur í litlum mæli skaltu draga úr öruggum rekstrarþrýstingi meðan á framleiðslu-stækkar og taka frá viðeigandi vinnsluþolssvið.

2. Fínstilltu krossflæðishraðann
Koma á stöðugu jaðarlagi og draga úr styrkskautun við himnuyfirborðið í gegnum krossflæði og lágmarka þannig próteinuppsöfnun á himnuyfirborðinu við upprunann.

3. Takmarkaðu lokastyrk eftir styrkingu
Skilgreina styrkleikamörk sem byggjast á eðlisefnafræðilegum eiginleikum próteinsins og forðast of mikinn fóðurstyrk. Fyrir mAbs fer venjubundinn lokastyrkur yfirleitt ekki yfir 50 mg/ml; fyrir suma samsöfnunar-mAbs, ætti styrkurinn að minnka enn frekar.

4. Stjórna pH og leiðni fóðurs
Haltu stöðugri vökvaðri kornastærð próteinsins og forðastu sameindasamdrátt af völdum truflana á sýru/basa eða jónastyrk-.

(B) Búnaður og rekstrarstýringar

1. Framkvæmdu heilleikapróf á himnuhylki fyrir hverja lotu
Framkvæmdu loftbólu-punktapróf fyrir framleiðslu á hverri lotu til að bera kennsl á brotnar himnutrefjar. Farga skal skemmdum himnusnældum tafarlaust til að koma í veg fyrir stöðugan próteinleka.

2. Staðlaðu CIP hreinsunarferlið
Stjórna NaOH styrk og snertitíma. Eftir sterka basíska hreinsun skaltu koma himnuefninu í jafnvægi til að draga úr hættu á aflögun himnuhola.

3. Notaðu þrepaða síun
Notaðu stóra-stuðpúðaskipti á fyrstu stigum til að fjarlægja sölt og hægðu á flæðisflæðishraðanum þegar endapunkturinn nálgast til að draga úr dragi og tapi próteina.

 

III. Að koma á fót ferlihönnunarrými í gegnum DOE (QbD Process Characterization; Gildir fyrir IND-uppgjöf)

1. Þáttaskimun
Skjáðu fimm lykil UF/DF ferlibreytur (P): þrýstingur yfir himnu, straumhraða fóðurs, upphafsstyrkur próteina, pH fóðurs og vinnsluhitastig.
Viðbragðsbreytur: áframhaldandi afrakstur, próteininnihald í gegndræpi, himnuflæði og hlutfall há-mólþunga-mólþunga.

Með marktektargreiningu, auðkenndu lykilþættina sem stuðla að próteinleka.

2. Svar yfirborðslíkön
Veldu færibreyturnar fjórar sem hafa mesta þýðingu til að búa til svaryfirborð og greina víxlverkanir milli breytu. Við margar rekstraraðstæður getur ein færibreyta haldist innan hæfissviðs þess, á meðan samsetning tveggja breytu getur leitt til próteinsgegndræpis. Ekki er hægt að bera kennsl á slík víxlverkunaráhrif með hefðbundnum-þátta-tilraunum-í einu-. Byggt á líkaninu, skilgreindu starfhæft hönnunarrými. Svo lengi sem breytur ferlisins eru innan þessa marka er hægt að tryggja skilvirka prótein varðveisla á meðan óhreinindi eru fjarlægð með síun.

3. Versta-tilfelli áskorun (krafist til að lýsa ferli)
Veldu ferlibreytur á ystu mörkum rekstrarmarka til að líkja eftir framleiðslubreytileika: hámarks TMP, lágmarks þverflæðishraða og efri-próteinstyrkur. Gakktu úr skugga um að jafnvel við erfiðar rekstraraðstæður eigi sér ekki stað-mikið markpróteintap og uppfyllir þar með kröfur CMC endurskoðunar.

 

IV. Margar greiningaraðferðir til að bera kennsl á prótein sem greindust í gegndrættinum og greina mark-mAb, niðurbrotsbrot og HCP

Byggt á skilvirkni greiningar, kostnaði og eftirlitssviðsmyndum er hægt að skipta aðferðunum í tvo flokka: hraðskimun og staðfestingarpróf. Forgangsraða ætti skjótum aðferðum við reglubundið eftirlit með ferlum; þegar óeðlileg frávik eiga sér stað ætti að nota nákvæmar auðkenningaraðferðir.

1. UV litrófsmæling (hröð skimun á netinu; æskilegt fyrir venjulega verslunar-gólfeftirlit)
Safnaðu gegndrættinum og mældu A280 gleypni þess. Þetta getur aðeins ákvarðað hvort prótein sé til staðar í gegndreypinu og getur ekki greint próteintegundirnar. Það er aðallega notað fyrir venjubundið ferlieftirlit. Stöðugt hækkandi A280 gildi gefur til kynna versnandi próteinleka og krefst tafarlausrar stöðvunar á síun og rannsókn á ferlinu.

2. SDS-PAGE rafdráttur (algengasta eigindleg auðkenningaraðferðin)
Notaðu afoxandi og ekki-minnkandi rafdrætti og berðu saman staðsetningar bandsins við staðsetningar mAb-markmiðsins í hráefninu:
1) Ef bandstaðan er algjörlega í samræmi við mark mAb hefur ósnortið mAb gegnsýrt himnuna.
2) Ef lægri-mólþungabönd birtast hefur próteinið gengist undir vatnsrofsklorun, sem myndar mAb brot.
3) Ef böndin eru dreifð með mörgum ýmsum böndum eru flest hýsilfrumuprótein (HCP) frá E. coli/CHO hýsilfrumum frekar en markafurðin.

3. Há-afköst stærð-útilokunarskiljun (HPSEC)
Aðskildu efnisþætti eftir sameindastærð og berðu saman skolunartíma þeirra við hráefnisskiljunina:
- Aðaltoppur með sama varðveislutíma og mAb gefur til kynna ósnortið markprótein.
- Toppur sem skolaðist út fyrr gefur til kynna mikla-sameinda-samstæðu/brot.
- Toppur sem skolar út síðar gefur til kynna lág-sameinda-niðurbrotsbrot.
- Skortur á einkennandi aðaltopp bendir til HCP óhreinindapróteina.
Þessi aðferð getur veitt megindleg gögn og getur verið innifalin í rannsóknarskýrslum um frávik ferlis; það hefur mikla viðurkenningu í klínískum uppgjöfum.

4. HCP hýsil-frumuprótein ELISA kit prófun
Ef prótein greinist í gegndrættinum, ELISA niðurstaðan er hækkuð og HPSEC sýnir engan einkennandi mAb topp, er í grundvallaratriðum hægt að ákvarða að efnið sem leki sé CHO hýsil-frumuprótein. Þetta gefur til kynna ófullkomið óhreinindi við hreinsun andstreymis; óhreinindin eru skoluð út á UF/DF stiginu og tákna ekki vörutap.

5. Sannprófun á sækniskiljun (Prótein A litskiljun)
Prótein A binst sérstaklega Fc svæði mAbs. Hlaðið gegndræpisýninu á súluna: útlit einkennandi skolunartopps gefur til kynna að ósnortið markmótefni sé til staðar; skortur á skolunartopp sýnir að próteinin í gegndreypinu eru öll óhreinindisprótein.

6. Massagreining (LC-MS) (í-dýpt rekjanleika; notað til að rannsaka meiriháttar ferli frávik)
LC-MS getur greint amínósýruröðina beint og ákvarðað nákvæmlega uppruna próteinsins. Það er aðallega notað til að rannsaka erfiðar eða óvenjulegar frávik og er ekki notað sem venja í-ferlisstýringarprófi.

V. Leiðréttingaraðgerðir sem samsvara mismunandi greiningarniðurstöðum

1. Ósnortið mark mAb greinist í gegndrættinum
Draga úr himnuþrýstingi og lokastyrk eftir styrkingu; þrengja vinnslusviðið byggt á DOE niðurstöðum; og athugaðu heilleika himnusnælda.

2. Niðurbrotsbrot mótefna sem greindust í gegndreypinu
Rannsakaðu skurðálag í gegnum ferlið og öfgar pH; hámarka andstreymis veiruóvirkjunarskrefið til að draga úr klofningi próteina.

3. Aðeins HCP óhreinindi prótein greind í gegndreypinu
Engin aðlögun á UF/DF breytum er nauðsynleg. Rekja málið aftur til undanfarandi litskiljunarþrepa og bættu óhreinindi við sækni- og jónaskiptaskiljun-.

 

VI. Samantekt

Til að koma í veg fyrir próteinleka meðan á UF/DF stendur, byggir hefðbundin ferlistýring á sögulegri reynslu til að skilgreina einstakar punktfæribreytur, sem geta aðeins tekið á stöðugri-lítilframleiðslu. Til að tryggja stöðuga frammistöðu meðan á þrepum ferli skala-upp, ætti að nota DOE-ferlaeinkenni til að koma á ferlihönnunarrými með nægilegt umburðarlyndi. Stýring á færibreytum sem byggir á bili- getur bætt upp fyrir framleiðslubreytileika. Þegar prótein hefur fundist í gegndreypinu getur einfalt UV-skynjunarkerfi gefið fyrstu viðvörun, fylgt eftir með rafdrætti, HPSEC og ELISA til að rekja og bera kennsl á. Þetta gerir nákvæma greinarmun á markvöru og -hýsilfrumuóhreinindum, sem gerir markvissa rót-rannsókn og aðgerðir til úrbóta kleift. Þetta er einnig staðlað rannsóknarþáttur sem nú er innifalinn í CMC skjölum fyrir mAb verkefni.