Notkun ofsíunar við framleiðslu á hundaæðisbóluefni fyrir menn
Til að stuðla að beitingu ofsíunar við framleiðslu á hundaæðisbóluefni úr mönnum, var 300kDa ofursíunarhimnusnælda notuð til að einbeita hundaæðisveiruuppskerulausninni og greina endurheimt mótefnavaka, endotoxínfjarlægingarhraða og hýsilpróteinfjarlægingarhraða eftir ofsíun. Niðurstöðurnar sýndu að undir viðeigandi þrýstingi var hundaæðisveiruuppskerulausnin þétt 80 sinnum, skoluð 25 sinnum, endurheimtarhlutfall mótefnavaka var 86.2%, endótoxínfjarlæging bakteríu var 87.5% ~ 88.7%, og hlutfall hýsilpróteins að fjarlægja var 91,6%.
Formáli
Hundaæði er hefðbundinn, forn dýrasjúkdómur af völdum hundaæðisveiru (RV), þar sem dánartíðni er allt að 100%. Sem stendur er engin áhrifarík meðferð við eftir útsetningu (þ.e. skemmdum á húð og slímhúð) önnur en bráðabóluefni og immúnóglóbúlínbólusetning. Helsta uppspretta hundaæðis í mönnum er bit frá sjúkum eða hugsanlega sýktum dýrum (aðallega hundum). Dánartíðni hundaæðis í Kína er í öðru sæti í heiminum og hundaæði er eitt af vandamálunum sem ógna lýðheilsuöryggi í okkar landi. Hylkisglýkóprótein hundaæðisveiru, sem er eini lykilmótefnavakinn sem veldur framleiðslu á verndandi hlutleysandi mótefni, hefur verið í brennidepli í rannsóknum og þróun nýrra bóluefna og nýrrar greiningar- og meðferðartækni fyrir hundaæðisveiru.
Hundaveiran tilheyrir ættkvíslinni hundaæðisveiru af rábdoveiru fjölskyldunni. Lögun kjarnakapsíðsins er teygjanleg, kjarnakapsíðið er helískt samhverft og yfirborðið hefur hjúp sem inniheldur einþátta RNA. Það er sýkillinn sem veldur hundaæði. Hundaæðisveiran hefur tvo aðalmótefnavaka: annar er glýkópróteinmótefnavakinn á ytri himnu veirunnar, sem getur bundist asetýlkólínviðtakanum til að gera veiruna eitraða á taugaeitrun, og framleiðir hlutleysandi mótefni og hemaglútínunarhamlandi mótefni í líkamanum, og hlutleysandi mótefnin hafa verndandi áhrif; Hinn er innri ríbóprótein mótefnavakinn, sem getur valdið því að líkaminn framleiðir komplement bindandi mótefni og botnfall, og hefur engin verndandi áhrif.
Endotoxín er eins konar lípópólýsykra efni (LPS), sem hefur hitaþol og efnafræðilegan stöðugleika og er ekki auðvelt að eyða. Ef ákveðinn styrkur endotoxíns er í bóluefninu veldur það miklum hita og jafnvel dauða eftir bólusetningu og því ætti að minnka innihald endotoxins í bóluefninu eins og hægt er. Árið 2005 útgáfa af kínversku lyfjaskránni (Hluti III) var ákveðið að viðmiðunargildi viðurkennds vísitölu hundaæðisbóluefnis endotoxins ætti ekki að vera hærra en 100EU/skammtur. Með hraðri þróun himnuaðskilnaðartækni er beiting ofsíunarhimnuaðskilnaðartækni til að draga úr innihaldi endotoxíns í bóluefnum að verða meira og meira útbreidd í lyfjaiðnaðinum.
Hundaæðisbóluefni er bóluefni gegn hundaæði. Það eru venjulega þrjár gerðir hundaæðisbóluefna, þar á meðal hreinsað Vero-frumubóluefni, tvílitna frumubóluefni úr mönnum og frumfrumuræktunarbóluefni. Hundaæðisbóluefni er búið til með því að sáð hafa hundaæðisveiru fasta vírus inn í frumufylki, eftir ræktun, uppskeru, þéttingu, óvirkjun, hreinsun og bæta við viðeigandi stöðugleika. Meginhlutverk hundaæðisbóluefnis er að örva líkamann til að framleiða hröð ónæmissvörun og framleiða verndandi mótefni gegn hundaæðisveiru, til að koma í veg fyrir sýkingu af völdum veirunnar og draga úr hættu á sjúkdómum.
Framleiðsluferli bóluefnis gegnir mikilvægu hlutverki við að tryggja gæði bóluefnis, sérstaklega er magngreining sumra vísbendinga í framleiðsluferli mikilvægara. Í framleiðsluferli hundaæðisbóluefnis fyrir menn er útsíunarþéttnitækni nauðsynleg leið til að framleiða hundaæðisbóluefni fyrir menn. Með því að nota skynsamlega ljósops ofsíunarhimnu fyrir ofsíunarstyrk er hægt að fjarlægja endotoxín og hýsilprótein á áhrifaríkan hátt og halda RV mótefnavaka, sem stuðlar að framleiðslu bóluefnis og bæta gæði. Hlutfallslegur mólmassi RV sameinda er 350kDa ~ 460kDa, og fræðilega séð er hægt að loka RV algjörlega með ofsíunarþéttni með því að nota himnuhylki með hlerunarmólþunga 100kDa og 300kDa. Endotoxín myndar oft söfnunarbyggingu í mismunandi vatnslausnum, vegna samloðunarstigs er sameindastærðin mismunandi. Hlutfallslegur mólmassi endotoxín einliða er 10kDa ~ 20kDa og hlutfallslegur mólmassi fjölliðunarformsins er 300kDa ~ 1000kDa eða meira en 1000kDa. Byggt á mismun á mólþunga var RV mótefnavaki í hundaæðisbóluefni í mönnum haldið eftir og endotoxín og hýsilprótein í hundaæðisbóluefni úr mönnum voru fjarlægð með 300kDa ofsíunarhimnu.
Í þessari tilraun var útsíunarhimnuhylki með 300kDa ljósopi og 0,11m2 himnuflatarmáli notuð sem lítið sýnismeðferð til að einbeita milliefnisafurðum úr hundaæðisbóluefni úr mönnum og himnuflæði, meðferðarhagkvæmni, margfeldisþéttni, hlerun mótefnavaka, fjarlægingu endotoxins , og hýsilprótein fjarlægð var prófuð.
2Efnisaðferð
2.1 Tilraunaefni
Hundaæðisveiru fastur CTN-IV stofn veiru; Vero frumur; 0.5M natríumhýdroxíð; 300kDa ofursíunarhimnusnælda (PES efni, 0,11m² himnuflatarmál).
2.2 Tilraunaaðferðir
2.2.1 Undirbúningur vírusuppskerulausnar
Frosnar Vero frumur voru endurlífgaðar í heitu vatni við 37 gráður ~ 39 gráður, frumusviflausn var dreypt úr þeim og síðan bætt við 199 ræktunarmiðil sem innihélt 10% óvirkt kálvasermi. Samræmdar einlaga frumur voru ræktaðar við 37 gráður. CTN-IV stofninn var sáð með hundaæðisveiru í hlutfallinu 0.1mól/L og ræktaður við 37 gráður. Eftir 48 klst. var ræktunarmiðlinum hent og 199 ræktunarmiðli sem innihélt 0,1% mannablóðalbúmín var bætt við til að halda ræktuninni við 33 gráður ~ 35 gráður. Uppskeru sjúkdómseitrið einu sinni á 3 daga fresti-5dag og sameinaðu marga uppskeruvökva.
2.2.2 Uppsetning á himnuhylki
Settu himnuhylkið upp og tengdu raflögnina eins og sýnt er á myndinni hér að neðan.
2.2.3 Vatnsþvottur
Lokaðu inntakslokanum, afturlokanum og í gegnum lokann og settu afturendann og í gegnum endapípuna í úrgangsvökvatankinn. Fylltu inntakstankinn með 1L af vatni fyrir inndælingu.
Opnaðu inntaks- og afturlokana, lokaðu gegnumlokunum, opnaðu dæluna, hreinsaðu afturleiðsluna með 10% rúmmáli af hreinsuðu vatni eða vatni til inndælingar og haltu inntaksþrýstingnum við 0,35bar (5psi).
Opnaðu síulokann, lokaðu afturlokanum og notaðu það sem eftir er af inndælingarvatninu til að þrífa síurörið og haltu TMP við 0.35bar.
2.2.4 Sótthreinsun
Lokaðu inntakslokanum, afturlokanum og flutningslokanum og settu afturendann og flutningsendalínurnar í úrgangsvökvatankinn. Fylltu inntakstankinn með 2L af hreinsilausn.
Opnaðu inntaks- og afturlokana, lokaðu gegnumlokunum, opnaðu dæluna, hreinsaðu afturleiðsluna með 200ml af 0,5M natríumhýdroxíði og haltu inntaksþrýstingnum við 0,35bar (5psi) .
Opnaðu gegnumlokann, lokaðu afturlokanum og hreinsaðu gegnumpípuna með 200mL rúmmáli af hreinsilausn og haltu TMP við 0,35bar.
Síðan er afturendanum og gegnumendapípunni stungið inn í vökvatankinn til hringlaga hreinsunar. Hringrás hreinsunar með 1 ~ 1,5 sinnum ferli snertiflæðishraða í 30 mín.
Tæmdu 0,5M af natríumhýdroxíði og skolaðu með vatni fyrir stungulyf samkvæmt 2.2.4 þar til hlutlaust.
2.2.5 Vatnsflæðispróf
Bættu hreinsuðu vatni í inntakstankinn, mældu og skráðu vatnshitastigið í inntakstankinum. Settu afturendann í tankinn. Ræstu dæluna og stilltu dæluhraðann og afturlokann til að ná fram 0.35bar (5psi) þrýstingsmun yfir himnu. Notaðu strokk til að mæla og skrá flæðishraðann í gegnum enda í ml/mín. Stilltu dæluhraða og afturloka til að fá 1bar (15psi) mismunadrif á himnu. Notaðu strokk til að mæla og skrá flæðishraðann í gegnum enda í ml/mín.
Til að staðla vatnsrennslisgildið skal deila reiknuðu vatnsrennslisgildinu með þrýstingsmun yfir himnu og margfalda leiðréttingarstuðulinn fyrir hitastig í eftirfarandi töflu.
2.2.6 Ofsíunarstyrkur
Þvoðu vatnið úr kerfinu með biðminni. Hringrás í 5 mín til að stilla pH og jónastöðugleika kerfisins. Ef stilla þarf hitastigið skaltu halda lotunni áfram þar til kerfishitastigið er stöðugt.
Bættu fóðurvökvanum við inntakstankinn, stilltu fóðurstreymishraða (td 400LMH) og prófaðu gegnumrennslið við mismunandi TMP gildi. Samkvæmt prófunargögnunum voru línur teiknaðar með TMP sem abscissa og Flux sem ordinata.
Beindu gegnumgangspípunni í viðeigandi ílát eða frárennsli, svo sem söfnunargeyma í gegnum enda, úrgangsvökvageyma og vinnsluhol.
Skráðu upphafsþyngd fóðurvökvans í fóðurtankinum, settu fóðurdæluna í gang og dreifðu fóðurvökvanum hægt í 3 mín til 4 mín. Endurhringrás getur hjálpað til við að fjarlægja loftleifar í flæðisleiðinni og hámarka þannig afköst filmunnar.
Opnaðu gegnumlokann, aukið dæluhraðann hægt þar til ákjósanlegum snertiflæðishraða er náð og stilltu afturlokann til að ná hámarks TMP kerfisins.
Settu síðan túpuna í söfnunarílátið, byrjaðu að tímasetja hvenær vökvinn fer í ílátið og skráðu inntaks- og afturþrýstinginn með viðeigandi millibili og skráðu gæði vökvans með tímanum í afturendanum og gegnum endana til að reikna út samstundis. rennslishraði.
Ofsíunarstyrk sýnisins er lokið þegar vökvarúmmál fóðursins er minnkað niður í markstyrksrúmmálið.
2.2.7 Skilun
Settu inntaksrörið, áfyllingarrörið og afturpípuna í inntaksgeyminn, settu flutningsrörið í söfnunarílátið og settu söfnunarílátið á vogina til að hreinsa.
Opnaðu afturlokann, ræstu inntaksdæluna, opnaðu gegnumlokann, stilltu dæluhraðann og TMP að viðeigandi gildi. Opnaðu áfyllingardæluna, haltu vökvamagninu í inntakstankinum óbreyttu og byrjaðu á jafnrúmmálsskiluninni. Byrjaðu á tímasetningu þegar vökvinn fer í ílátið og skráðu þrýstinginn við inntaksenda, afturenda og massa vökvans á viðeigandi tímabili og fáðu augnabliksrennslishraða með útreikningi.
2.2.8 CIP
Skolaðu fyrst með stuðpúða, skolaðu síðan með vatni fyrir inndælingu (aðgerð 2.2.3), hreinsaðu síðan með hreinsiefni (aðgerð 2.2.4), og skolaðu að lokum með vatni fyrir inndælingu (aðgerð 2.2.3).
2.2.9 Vatnsflæðispróf
Starfsemin er sem hér segir: 2.4.5.
2.2.10 Varðveisla himnusnælda
Skammtímageymsla (minna en eða jafnt og 3 dagar), hafðu himnuhylkið í innréttingunni og notaðu geymslulausnina til að hjóla í 10 mínútur til 15 mínútur, loka kerfislokanum, slökkva á aflgjafa til vökvadælunnar og tryggja að vökvainntaksgeymirinn sé rétt lokaður.
Ef geymslutími er 3 dagar til 1 mánuður, vinsamlegast fjarlægðu himnuhylkið úr festingunni og innsiglið það í plastpoka eða annað loftþétt ílát. Bætið um 50mL til 100mL af geymslulausninni í plastpoka eða loftþétt ílát og innsiglið það. Eða hægt að dýfa því beint í geymslulausnina. Eftirfarandi tafla mælir með geymsluskilyrðum.
3 Niðurstöður og greining
3.1 Rannsókn á áhrifaþáttum á skilvirkni pýrógeneyðingar
Ofsíunarþrýstingur: 15 prófunarlotur voru keyrðar samfellt. Í hverri lotu var síunarþrýstingnum haldið við 5, 10, 15 og 2{{10}}psi meðan á ofsíun stóð og veiruuppskeruvökvinn var þéttur 30 sinnum og skolaður út með stuðpúðavökva (10 sinnum rúmmál) í stöðugu flæði. Niðurstöður eins og sýndar eru í töflunni hér að neðan, fjarlægingarhlutfall endótoxíns var minna en 87,0%, endurheimtarhlutfall mótefnavaka var stöðugt við 86,0% og fjarlægingarhlutfall hýsilpróteins var stöðugt við 90,0%, sem gefur til kynna að mismunandi rekstrarþrýstingur hafi lítil áhrif á áhrif endurheimt mótefnavaka, brottnám endotoxíns og fjarlægingu hýsilpróteina.
Styrkhlutfall útafsíunar: 15 prófunarlotur voru keyrðar samfellt. Í hverri lotu var veiruuppskeruvökvinn þéttur 30 sinnum, 50 sinnum, 80 sinnum og 100 sinnum, í sömu röð, við ofsíun. Síunarþrýstingnum var haldið við 20psi og biðminni vökvinn (10 sinnum rúmmálið) var skolaður í stöðugu flæði. Niðurstöður eins og sýndar eru í eftirfarandi töflu, fjarlægingarhlutfall endotoxíns var á bilinu 53,3% til 86,9%, endurheimtarhlutfall mótefnavaka hélst stöðugt við 86,0% og brottnámstíðni hýsilpróteins var stöðugt í 91,0%. Í sundri sýnatöku greindist enginn mótefnavaki í smitlausninni og minna en 10% af hýsilpróteini var eftir í óblandaðri veirulausninni. Styrkur endotoxíns í óblandaðri veirulausninni jókst með aukningu styrkleikatímanna og endotoxínfjarlægingarhraði var 80 sinnum hæstur í óblandaða sýninu, og framleiðandinn gæti einnig talið styrkinn 100 sinnum, sem ekki aðeins bætti framleiðsluhagkvæmni og lækkaði kostnað, en uppfyllti einnig kröfur um bóluefnisframleiðslu.
3.2 Fluxeyðing á himnusnældu og endurnýjun hreinsunar
Eftir meðferð var endurheimtarhlutfall himnuflæðis 92,6%. Fyrsta endurheimtarhraði nýju himnusnælunnar er eðlilegt, í samræmi við núverandi athugunareiginleika fóðurvökvans, síðari spá um annað og NTH skipti, mun endurheimtarhraði himnuhylkisins vera nálægt gögnunum eftir þessa meðferð, og hafa tilhneigingu til að vera stöðug. Innan 2 klst. eftir einnota notkun var eyðing himnuhylkis tilvalin og aðeins 10% af himnuflæðinu tæmdist við heildaraðgerð.
3.2.1 Fluxeyðing í ferli himnusnældameðferðar
3.2.2 Niðurstaða hreinsunar og endurnýjunar á himnuhylki
Um Guidling
Guidling Technology er innlent hátæknifyrirtæki sem leggur áherslu á líflyf, frumurækt, hreinsun og styrk líflækninga, greiningu og iðnaðarvökva. Við höfum þróað miðflótta síu tæki, ofursíun og örsíun snælda, vírus síu, TFF kerfi, dýpt síu, holur trefjar, o.fl. Sem uppfylla að fullu umsóknarsviðsmyndir líflyfja, frumuræktunar, og svo framvegis. Himnur okkar og himnusíur eru mikið notaðar við styrk, útdrátt og aðskilnað forsíunar, örsíunar, ofsíunar og nanósíunar. Margar vörulínur okkar, allt frá lítilli einnota rannsóknarstofusíun til framleiðslu síunarkerfa, ófrjósemisprófun, gerjun, frumurækt og fleira, uppfylla þarfir prófana og framleiðslu. Guidling Technology hlakkar til að vinna með þér!
