Bókmenntir deila|Kveðja flókna hreinsun? Skáldsaga TFF + yfirborðsvirka aðferð bætir skilvirkni og dregur úr kostnaði við framleiðslu AAV vektor

Genameðferð er að þróast hratt, en samt er mikill kostnaður hennar mikill hindrun sem kemur í veg fyrir víðtækari aðgang sjúklinga. Meðal helstu drifkrafta þessa kostnaðar er flókið framleiðsluferli adeno - tengd vírus (AAV) vektorar. Rannsókn sem birt var í líftækni og lífverndun hefur þróað nýja hreinsunaraðferð sem sameinar snertingu flæðissíun (TFF) með yfirborðsvirkum efnum, sem lofar að einfalda AAV hreinsunarferlið og draga úr kostnaði. Við skulum kafa í þessari rannsókn undir forystu teymis frá háskólanum í Tókýó.

 

1. Rannsóknargrundvöllur: Áskoranir og núverandi staða AAV hreinsunar

AAV vektorar eru orðnir „stjörnu“ afhendingartæki í genameðferð vegna mikils öryggis þeirra, lítillar ónæmingargetu, getu til að smita bæði aðgreining og ekki - aðgreiningarfrumur og getu til langs - hugtaks genatjáningar. Hins vegar er framleiðsluferlið þeirra flókið, sérstaklega hreinsunarskrefin í eftirstreymi, sem venjulega fela í sér margar umferðir af skilvindu og litskiljun. Þessar aðferðir eru tími - neysla, vinnuafl - ákafur, erfitt að kvarða og kostnaðarsamur.

Á rannsóknarstofu mælikvarða treystir hreinsun oft á cesíumklóríð eða joddixanólþéttleika halla ultracentrifugation, sem er krefjandi að mæla fyrir iðnaðarframleiðslu. Sækni litskiljun er í auknum mæli notuð, en lágt pH skolunaraðstæður sem það þarfnast geta skert smitun veiru. Þess vegna er mikilvægt að þróa einfalda, skilvirka, mildan og stigstærð AAV hreinsunaraðferð.

Tangential flæðissíun (TFF) er stærð - byggð aðskilnaðartækni sem oft er notuð til að einbeita sér og biðminni - að skiptast á lífframleiðslu. Hefðbundin TFF hefur þó takmarkaða getu til að fjarlægja óhreinindi eins og hýsilfrumuprótein (HCP) og DNA við AAV hreinsun og skilja oft eftir próteinöflun eftir.

 

2.. Nýsköpunaraðferð: TFF ásamt yfirborðsvirkum efnum til að fá skilvirka hreinsun

Til að vinna bug á takmörkunum hefðbundinna TFF, hugaði vísindamennirnir Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa og samstarfsmenn við háskólann í Tókýó snjallri stefnu: með því að nota yfirborðsvirk efni til að hindra samsöfnun og milliverkanir á milli Its (500 kDa mólefnisþvottar) á meðan skurðabólga var haldin) (500 kDa mólþyngd) nm að stærð).

Þeir prófuðu þrjár tegundir yfirborðsvirkra efna:

• Ekki - jónandi:Octyl glúkósíð
• Anjónískt:Natríum deoxycholate
• Zwitterionic:Chaps

Rannsóknin kom í ljós að það var árangurslaus að nota ekki - jónískt yfirborðsvirkt efni. Bæði anjónískt natríum deoxycholate og zwitterionic chaps eykur marktækt að fjarlægja leifar próteina og þeir miðuðu við mismunandi próteinstofna. Á endanum, með því að sameina 0,5% natríum deoxycholate með 1% CHAP, skilaði ótrúlegum árangri og útrýmdi næstum fullkomlega eftirliggjandi hýsingarpróteinum. SDS - blaðagreining sýndi aðeins þrjú skýr AAV hylkispróteinbönd (VP1/VP2/VP3).

 

Mynd 1. TFF hreinsunarferli án yfirborðsvirkra efna;(a) SDS - Page hlaup rafskaut; (b) Sending rafeindasmásjá (TEM)

 

Mynd 1. TFF hreinsunarferli með yfirborðsvirkum efnum;(a) SDS - Page hlaup rafskaut; (b) Sending rafeindasmásjá (TEM)

 

3.. Rannsóknarniðurstöður: Mikil hreinleiki, virkni og öryggi

1. Skilvirk óhreinindi:Nýja aðferðin náði 99,98% að fjarlægja HCP og 95% fjarlægingu DNA, með hreinleika sambærilegan við eða fara yfir sækni litskiljun.
2. Bætt smitvirkni:In vitro tilraunir sýndu að AAV1 vektorar hreinsuðu með þessari aðferð smituðu HEK293 frumur á skilvirkari hátt en þær sem voru hreinsaðir með sækni litskiljun (24,9% á móti 20,8%), sem bendir til betri varðveislu lífvirkni veiru.
3. Gott in vivo öryggi:Eftir staðbundna inndælingu af hreinsuðum AAV1 vektorum í beinagrindarvöðva músar, sást engin marktæk bólga eða vefjaskemmdir eftir tvær vikur, sem sýndi góða öryggi in vivo.
4. Víðtæk gildistækni:Aðferðin hreinsaði með góðum árangri margar sermisgerðir - þar á meðal AAV1, AAV5, AAV8 og AAV9-frá frumuræktandi supernatants. Hins vegar, fyrir AAV2, sem er aðallega til í frumulýsötum með mikla óhreinindi, er þörf á frekari hagræðingu.

 

4. yfirlit og horfur

Þessi rannsókn þróaði einfalt, hratt (1,5 klukkustundir), skilvirkt og stigstærð nýtt AAV hreinsunarferli. Með því að sameina natríum deoxycholate og chaps tók það með góðum árangri við áskorunina um samsöfnun próteina sem eftir er við TFF hreinsun.

Kostir aðferðarinnar fela í sér:

• Forðast hörðum lágum sýrustigi, betri varðveislu veiruvirkni
• Að draga úr litskiljun, einfalda verkflæðið og spara tíma og kostnað
• Auðvelt stigstærð, hentugur fyrir iðnaðarstóra - kvarða framleiðslu
• Að veita nýja stefnu til að hreinsa aðrar lífeðlrómólýkingar eins og exosomes, aðrar vírusar og raðbrigða mótefni

Núverandi takmarkanir fela í sér undiroptimal veiru endurheimt og vanhæfni til að aðgreina tóma hylki frá fullum veiruagnum, sem bendir til þess að best notkun þess geti verið fyrsta - þrep handtaka í multi - þrephreinsunarferli.

Að lokum, þessi rannsókn býður upp á aðlaðandi nýjan valkost fyrir framleiðslu AAV vektors og hefur möguleika á að draga verulega úr kostnaði við genameðferðarlyf og auðvelda víðtækari notkun þeirra.