Yfirlit:

Þessi grein fer yfir tvo lykilatriði sem þarf að hafa í huga í próteinhreinsunaraðferðum: kröfur um notkun downstream og líffræðileg einkenni próteina sjálfra. Í greininni er lögð áhersla á að hágæða próteinhreinsun er grunnurinn að áreiðanleika og endurtekningarhæfni tilraunagagna, sérstaklega til framleiðslu á raðbrigða próteinum. Mismunandi atburðarásar hafa sérstakar kröfur um prótein hreinleika, virkni eða endótoxíninnihald og einkenni próteina geta haft áhrif á hreinsunaraðferðirnar verulega. Samkvæmt tilteknum tilvikum sýnir greinin að einstök prótein ættu að nota sérsniðin hreinsunarkerfi. Að lokum var lagt til kerfisbundið próteinframleiðsluferli (mynd 1), með áherslu á gæðaeftirlit með fullri vinnslu frá vali á tjáningarkerfum, byggingarhönnun til fínstillingar hreinsunar og mælti með mati á einsleitni próteina og virkni með lífeðlisfræðilegum tækni (svo sem Sec-Mals, DSF osfrv.). Þessi grein miðar að því að veita vísindamönnum hagnýtar leiðbeiningar og hjálpa þeim að móta skilvirkar og endurteknar hreinsunaráætlanir byggðar á einkennum og umsóknarkröfum markpróteina og auka þannig gæði og skilvirkni vísindarannsókna.

 

Mynd 1. Skýringarmynd af próteinframleiðsluferli

 

Próteinframleiðsla með mikla eftirspurn - Dæmi um auðkenningu vandamála, mótvægisstefnuhönnun og samsvarandi framleiðsla

 

1. Nucleic sýrubinding við prótein:

Þegar hreinsað er kjarnsýru bindandi prótein er þörf á mörgum skrefum til að fjarlægja mengun kjarnsýru. Við lýsingu þarf að bæta við kjarni (svo sem SM Nuclease (Benzonase®) eða DNase eða RNase), en ekki er hægt að fjarlægja bundnar kjarnsýrur að fullu. Skiptu um kjarnsýru fjarlægingarþrep, svo sem PEI eða streptómýsínsúlfat úrkomu, heparínhreinsun eða jónaskipta litskiljun. Fylgst var með nærveru kjarnsýrna með hlutfalli A26 0 nm/A28 0 nm í öllu hreinsunarferlinu. Ef hlutfallið var lægra en 0,6 benti það til þess að próteinhreinleiki væri tiltölulega mikill og mengun kjarnsýrunnar var í lágmarki. Fyrir prótein með sterkar bundnar kjarnsýrur er hægt að afnema þær tímabundið (svo sem meðhöndlaðar með þvagefni) og síðan endurfluttar. Lykilatriði: Notaðu hágæða hvarfefni, ferskt stuðpúða og hreinar súlur (hreint með 0,5 m NaOH fyrir notkun).

 

2. Mús Ferritin Heavy Chain:

Tilgangurinn með því að framleiða hreinsað mús ferritín þungt keðju (MFTH1) prótein er hár-upplausn eins ögn Cryo-Electron smásjá (Cryo-EM). Escherichia coli tjáningarvektorinn sem var kóðaður ómerktur MFTH1 truflaði ultrasonically án þess að bæta við neinum kjarni. Eftir upphitun við 7 0 gráðu fór það í ammoníumsúlfat úrkomu, skilun og stærð útilokunar litskiljun. Sýnið sem myndaðist sýndi tilvist mikils magns af mengunarefnum í Cryo-Electron smásjármyndum (mynd 2A), sem var alveg óhæf til notkunar þess. Fínstilltu skrefin. Bætið SM kjarni við frumulýsingarferlið og skilunarferlið eftir ammoníumsúlfat úrkomu og bætið síðan við anjónaskipta litskiljun til að draga úr hlutfalli A26 0 nm/A280nm frá 1,4 til 0,8. Eftir útilokun litskiljun var hlutfall A260Nm/A280Nm loka MFTH1 sýnisins 0,56. SDS-PAGE og Cryo-Electron smásjármyndirnar (mynd 2B) sýndu að próteinið var mjög hreint, sem benti til þess að mengunarefnin hafi verið fjarlægð í raun.

Mynd 2 mús ferritín þung keðja

 

 

 

3. Chimeric prótein manna dsrbec (dsrbd-egf- chimera):

DSRBEC er myndað með samruna tvístrengda RNA bindandi léns (DSRBD) á próteinkínasa R og vaxtarþáttum úr húðþekju manna (HEGF). Þegar DSRBD er tjáð í Escherichia coli sýnir það afar mikla dsRNA bindandi getu. Eftir frumulýsingu mun RNA mengunin hindra bindingu raðbrigða próteina við fastan málm jón sækni litskiljun (IMAC) dálkinn. Hefðbundnar aðferðir eins og PEI eða Streptomycin súlfat úrkomu, RNase meðferð eða há-saltjafnalausnir geta ekki fjarlægt RNA. Frumulýsing var framkvæmd með því að nota biðminni sem innihélt 4m þvagefni. Flotvatnið var hlaðið á IMAC dálk og 4m til 0 m þvagefni var hægt notað yfir nótt (dálkur endurnýjun). Renaturation stuðpúði var bætt við með imídazóli og skolað úr IMAC dálkinum. Endanleg fágun var framkvæmd í gegnum Superdex 75 gelsíun til að fá virkan virkan DSRBEC.

 

4. Prótein bundin tvígildum katjónum eða öðrum samverkandi:

Fyrir prótein sem hafa samskipti við tvígildar katjónir eins og Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ eða aðrir cofactors, er það lykilatriði að bæta við sérstökum tvígildum katjónum (eða öðrum cofactors) meðan á tjáningu stendur. Lítið magn af sömu tvígildum katjónum (eða öðrum cofactors) er einnig krafist meðan á hreinsunarferlinu stendur. Hins vegar verður að forðast notkun allra klóbindandi lyfja (svo sem EDTA, EGTA) og klóbindandi lyfja (svo sem DTT eða DTE). Þegar verið er að takast á við prótein sem bundin eru tvígildum katjónum verður að nota blöndu af próteasahemlum án klóbindandi lyfja til að staðfesta raunverulega nærveru tvígildra katjóna (eða annarra cofactors) í hreinsuðu próteininu með litrófsgreiningaraðferðum (svo sem atóm frásogs litrófsgreiningar).

 

5. Raðbrigða ferridoxin (RFD) sem inniheldur stakan [2fe ± 2s] þyrping frá hitauppstreymi cyanobacteria mastigocladus laminosus

Ferridoxin er leysanlegt járn-brennisteinsprótein sem tekur þátt í rafeindaflutningsviðbrögðum. Ferroredoxin af plöntum er með stakan [2Fe ± 2S] þyrping sem rafeindasamtak af ljósmyndakerfi I. Escherichia coli BL21 (DE3) stofninn sem tjáði raðbrigða RFD prótein í TB miðli sem innihélt 10mm FECL3 og sýklalyf. Skolun IMAC handtaka súlu var framkvæmd með því að nota biðminni sem innihélt 10mm histidín til að forðast imídasól og koma í veg fyrir eyðingu [2Fe ± 2S] þyrpingunnar. Anjónaskipti og útilokun litskiljun var notuð til frekari hreinsunar og styrks í 12 mg/ml til að kristalla skimun. Í samanburði við raðbrigða framleiðslu á ferroredoxíni, náði náttúrulega ferroredoxínið úr blágrænu þörungum mastigocladus laminosus hærri upplausn við kristöllun.

 

6. prótein notuð sem mótefnavaka

Prótein eru oft notuð sem mótefnavaka til að endurheimta mark-sértækar bindla. Það fyrsta sem þarf að hafa í huga er hvort próteinið er notað til friðhelgi in vivo til að fá hefðbundna einstofna eða fjölklóna IgG, eða fyrir forrit sem fela í sér úlfalda IgG eða in vitro valferla.

 

6.1 Mótefnavaka sem notuð eru við venjubundna mótefnaframleiðslu

Þegar mótefnavaka er notuð til að framleiða einstofna IgG mótefni, er rétt að brjóta saman mótefnavaka venjulega ekki nauðsynleg, vegna þess að flest einstofna mótefni þekkja línulegar eftirlíkingar sem hafa ekki mikil áhrif á uppbyggingu mótefnavakans og jafnvel afneitað mótefnavaka (svo sem að innifalið líkamsprótein) eru áfram árangursríkar. Hins vegar verður að stjórna hreinleika stranglega til að forðast sterk ónæmisvaldandi mengun sem truflar ónæmissvörun og valda yfirburði mótefna sem ekki eru markhópur.

 

6.2 Skimun á samtengdu bókasafninu

Sérstaklega ætti að huga að því að viðhalda náttúrulegri sköpun mótefnavaka við vinnslu nanobody bókasafnsins sem fengin var með úlfalda bólusetningu. Ólíkt hefðbundnum mótefnum, hafa úlfalda mótefni (sérstaklega nanobodies) tilhneigingu til að þekkja uppbyggingu eftirbyggingar, sem tengist einstöku kúptu viðbótaruppbyggingu þeirra. Að sama skapi, þegar skimað er stór tilbúin eða náttúruleg mótefnasöfn in vitro, verður mótefnavaka að viðhalda uppbyggingu sem er fullkomlega í samræmi við markmiðsnotkunina. Þar sem skimunarferlið sjálft er ekki hlutdrægt, ef mótefnavaka hefur rangfærslu, samsöfnun eða sköpunarleysi, má skima stóran fjölda samtengdra sem miða að óeðlilegum eftirlíkingum.

 

 

 

7. Prótein sem innihalda intermolecular eða intramolecular disulfide tengi eða ókeypis cystein

Disúlfíðbindingar skipta sköpum fyrir að koma á stöðugleika í náttúrulegu uppbyggingu próteina. Meðan á hreinsunarferlinu stendur, þegar hreinsað er prótein sem innihalda intermolecular eða intramolecular disulfide tengi, er nauðsynlegt að forðast að bæta við lækkunarlyfjum til að koma í veg fyrir breytingar á sköpunarbreytingum á próteinunum og breyta þannig virkni þeirra. Fyrir prótein sem innihalda ókeypis cystein eru afoxunarefni ómissandi í öllum skrefum hreinsunarferlisins, sérstaklega við geymslu, til að koma í veg fyrir myndun gervi disúlfíðbindinga. Algengustu afoxunarefnin eru dithiothreitol (DTT), -Mercaptoethanol (-Me) og Tris (2- karboxýetýl) fosfínhýdróklóríð (TCEP). Fyrir iMac kvoða sem eru ósamrýmanleg DTT eða TCEP er mælt með því að nota -me og skipta þeim út fyrir önnur afoxunarefni í síðari skrefum.

 

8. Raðbrigða mótefni brot

Þrátt fyrir að uppbygging raðbrigða mótefnabrots (svo sem nanobodies) sé einfaldari en IgG, þá er virkni þeirra háð réttri myndun disulfide bindinga. Í bakteríutjáningarkerfum, jafnvel með því að nota hagræðingaraðferðir, geta rangfaldar eða að hluta brotnar afurðir enn átt sér stað, sem eru bæði til í leysanlegum hluta og í aðgreiningaraðilanum. Meira hulin er að jafnvel rétt brotin mótefnabrot geta myndað leysanlegar samanlagðir (kolloid samsöfnun) með vatnsfælnum veggskjölum á yfirborðinu. Erfitt er að bera kennsl á slíkar samanlagðar í venjubundnum virkniprófum (svo sem ELISA) vegna þess að fjölgild binding getur dulið samdrátt í sækni í einliða, en nærvera þeirra getur haft alvarleg áhrif á forrit sem treysta á litla sameindastærð (svo sem smásjá yfir upplausn). Þess vegna er ekki nægjanlegt að treysta eingöngu á SDS-PAGE til að meta úrtaksgæðin. Nota verður lífeðlisfræðilegar aðferðir eins og hlaupsíun (mynd 3) til að greina einliða (aðaltoppar) frá samanlagðum (útilokunarrúmmálstoppum). Lykilstýringarstaðir fela í sér: Hagræðing Redox umhverfisins meðan á tjáningu stendur til að stuðla að myndun disúlfíðbindinga og hámarka geymsluaðstæður eftir hreinsun til að koma í veg fyrir samsöfnun. Þessar ráðstafanir skipta sköpum til að tryggja monodispersity og virkni mótefnabrotanna.

Mynd 3. Gel síun aðskilnaður leysanlegra samanlagða nanobodies

 

9. leysanleg brot úr eitilfrumuviðtaka LLT1

Raðbrigða tjáning á disúlfíðbindandi próteinum (svo sem eitilfrumuviðtaka LLT1) stendur oft frammi fyrir erfiðleikum. Gelsíun á villtum tegundum LLT1 sýndi samanlagðartopp og dimer tinda (mynd 4A), en massagreining leiddi í ljós rangfærslu af völdum óparaðs cystein í dimer (mynd 4B). Í þessu skyni voru tvö stökkbrigði hönnuð: einn fjarlægði vandamálið cystein, sem leiddi til skyndilegs lækkunar á afrakstri (mynd 4A); Eftir að neocysteine ​​var kynnt til að endurgera samsvarandi disulfide tengi, hafði stökkbrigðið ekki aðeins mikinn ávöxtun og góðan stöðugleika, heldur gæti hann einnig kristallað (mynd 4C), og 3D uppbyggingin staðfesti að stökkbrigðið myndaði réttan disulfide tengi og hélt náttúrulegu fellinu. Þetta tilfelli sýnir að með skynsamlega að hanna samsvarandi disulfide tengi, ásamt hlaupsíun og massagreiningargreiningu, er hægt að leysa fellingarvandamál raðbrigða próteina á áhrifaríkan hátt og hægt er að fá virkni próteina með stöðugu mannvirkjum og háum afrakstri.

Mynd 4.

 

 

 

10. Auðvelt samanlagður prótein

Hreinsun raðbrigða próteina stendur oft frammi fyrir samloðunarvandanum og myndun þess fylgir „kjarni vaxtar“ fyrirkomulagi-lítið magn af leysanlegum samanlagðum myndast fyrst og kalla síðan af stað í stórum stíl óleysanlegri samsöfnun. Til að takast á við þessa áskorun þarf að nota fjölstigsaðferðir: á tjáningarstiginu er hægt að ná þessu með því að hámarka álagið, draga úr ræktunarhitastiginu, nota breyttan ræktunarmiðla eða mismunandi leysandi samrunaprótein og skipta um tjáningarkerfi (skordýr/spendýrafrumur) osfrv. Meðan á hreinsunarstiginu stendur, skjótt notkun (í 4 gráðu umhverfi) er krafist til að forðast of mikla prótín og „hröðum hætti sem„ er til þess að “sé til að koma í veg fyrir að það sé„ til að stafa af prótíni og „hröðum hætti“ (svo að „sé tilhneigingu til að nota það sem„ er um að ræða um það sem „er um að ræða og“ og „. IMAC til Sec) ætti að nota til að fjarlægja samanlagða kjarna tafarlaust. Almennt talað, þegar skimun á biðminni lausnir, ætti að taka tillit til þátta íhluta, pH gildi, aðgreiningarefni eða leysiritara (mynd 5). Með fínri hagræðingu á rétthyrndri uppgötvun (svo sem Sec, Cd, LS, DSF og hitastigsbreytingu byggð á flúrljómunarhita osfrv.), Voru próteingæðin og heppilegustu stuðpúðarlausnin ákvörðuð.

Mynd 5. Aðferðir til að létta próteinjöfnun

 

11. Kristallun á CLK1 kínasa manna (hvernig á að fá fjölföldunarlotu)

Til að fá einsleitt CLK1 kínasa sem ekki voru fosfórýlerað fyrir kristöllunarrannsóknir var tekið upp fjölskipulagssamvinnukerfi. Í fyrsta lagi var það tjáð með λ -fosfatasa í Escherichia coli til að útrýma misleitni autophosphorylation. Þrátt fyrir að ávöxtunarkrafan hafi verið minnkuð var fullkomin fosfórýlering tryggð. Eftir handtöku IMAC var skolefni bætt við sveiflujöfnun (50 mm arginín, 50 mm glútamínsýru og 10 mm DTT) til að koma í veg fyrir samsöfnun, einbeitt, og merkið hans var fjarlægt með TeV meltingu. Þá var rétt fákeppni aðskilin með SEC (sem innihélt 5% glýseról og -me). Loka mikilvæga anjónaskiptaþrepið greinir á milli kristallaðs (ekki fosfórýleraðs) og ekki kristallaðs (að hluta til fosfórýleraðra) CLK1 hópa. Það er sérstaklega vert að taka fram að háttur frumulýsingar hefur verulega áhrif á próteinstöðugleika-háþrýstings og háhitaaðferðin leiðir til óafturkræfs samsöfnun CLK1, sem bendir á mikilvægi vægrar meðferðar fyrir kínasa undirbúning.

 

 

 

12. Framleiða galectin -1 með stöðugum bindillbindandi getu

Til að útbúa hagnýtur galectin -1 fyrir bindandi rannsóknir á bindandi rannsóknum, voru tjáning og hreinsunaráætlanir fjögurra smíða (ómerktar og merktar villigerð galectin -1, ómerktar og his-merktu cysteine-frjálsar stökkbreyttar stökkbreyttar galektín -1}) saman. Lykilniðurstöður benda til þess að hreinsun laktósa sækni litskiljun geti í raun skimað fyrir rétt brotin prótein, en það þarf að sameina það með ítarlegri skilun (HEPES stuðpúða) til að fjarlægja laktósa alveg frá bindistaðnum og endurheimta CRD virkni. Villt gerð galectin -1 er viðkvæmt fyrir oxun og óvirkjun og stöðugleiki þess er áfram takmarkaður jafnvel í viðurvist lækkunarefna (mynd 6). Hins vegar eykur cystein-frjáls stökkbreytingin verulega stöðugleika til langs tíma en viðheldur sambærilegri kekkjuvirkni og hitauppstreymi (staðfest með nanodsf, ITC osfrv.) Með því að útrýma disúlfíðbindingu.

Mynd 6.

 

13. Fjarlæging endótoxíns

Aðferð til að fjarlægja endotoxín er byggð á sækni litskiljun, þar með talin jákvætt hlaðin litskiljun (anjónaskipti), notkun marghliða bindla (svo sem pólý-l-lysín (PLL), óeðlilegt pólýamín (polymyxin B)) og viðbót við yfirborðsvirka triton x -114. Meðan á hreinsunarferlinu stendur skaltu fylgjast með því að undirbúa biðminni lausnina með LPS-lausu vatni og notaðu nýja dálka eða súlur sem aðeins hafa verið notaðir í öðrum LPS-lausum hreinsunum. Fyrir mengun endotoxíns er hægt að rækta litskiljunardælu/vökvakerfið yfir nótt í 0. Endanlegt magn LPS í sýninu var metið með því að nota Limulus amebocyte lysat hvarfefni (LAL) og var staðfest hvort það væri undir þeim mörkum sem krafist var fyrir tiltekna notkun.

 

14. Próteinfléttan

Tjáning og hreinsun próteinfléttna þarf að hámarka eftir sérstökum aðstæðum. Áskoranir fela í sér óstöðugleika eða misfellingu undireininga. Hægt er að tjá hverja undireiningu sjálfstætt og setja saman in vitro, eða tjá þau til að mynda virkni próteinfléttur. Kynna ætti smíði vandlega með hreinsunar- eða uppgötvunarmerki til að forðast að trufla samsetningu, sérstaklega þegar flóknar upplýsingar eru takmarkaðar og margar hagræðingar eru nauðsynlegar. Meðan á hreinsunarferlinu stendur þarf að meta heiðarleika og stöðugleika fléttunnar. Aðferðirnar fela í sér SDS-PAGE (uppgötvun undireininga), SEC (einsleitni), Sec-mals (mólmassa greining), massa ljósmyndun eða náttúruleg massagreining (massa sannprófun). Þess má geta að fléttan getur sundrað við lágan styrk. Á þessum tíma þarf að fínstilla litskiljun eða biðminni (svo sem með hitauppstreymi eða DSF skimunarskilyrðum). Ennfremur, með því að draga úr hreinsunarskrefunum getur komið í veg fyrir tap á veikum samskiptaeiningum og jafnvægi hreinsunarvirkni og heiðarleika fléttunnar.

 

 

 

15. Hreinsun á mótefnavaka-mótefna fléttum

Mótefna-mótefnavaka fléttur eru dæmigerð dæmi um próteinfléttur. Sam-kristöllun þeirra getur leitt í ljós bindandi mynstur og leiðbeint hagræðingu mótefnaverkfræði. Hefðbundnar aðferðir krefjast sérstakrar hreinsunar mótefnavaka og mótefna og blanda þeim síðan saman. Nýlegar rannsóknir hafa hins vegar sýnt að sam-tjáning og samhæfingaraðferðir eru skilvirkari. Aðeins er þörf á einni hreinsun til að fá fléttuna og á sama tíma er hægt að koma á stöðugum mótefnavaka með mótefnum og jafnvel hægt er að ná merkimiða. Í þessum sérstaka aðstæðum eru SDS-PAGE og hlaupsíun (SEC) venjulega nægjanleg til að meta hreinleika og gæði fléttunnar.

 

Yfirlit

Próteinhreinsun er grundvallartækni í vísindarannsóknum. Próteinframleiðsla í akademískum mælikvarði fylgir venjulega stöðluðum aðferðum og getur framleitt milligrömm stig með mikla hreinleika, leysanleg prótein, sem eru víða notuð í byggingarlíffræði, lífefnafræði og hagnýtum rannsóknum. Sérstakar kröfur um notkun downstream (svo sem þörfin á engum endótoxíni í dýratilraunum og engin kjarnamengun í kjarnsýrurannsóknum) eða eðlislæg einkenni próteina (svo sem auðveld samsöfnun, sem innihalda disulfide tengi eða mikla kjarnsýru sækni) þurfa oft sérsniðnar lausnir. Í þessari endurskoðun, til að bregðast við þessum sérstöku kringumstæðum, leggur til hreinsaðar aðferðir, allt frá vali á tjáningarkerfum, hönnun smíðanna (hámarkar merkimiða og lénsmörk) til hreinsunarferlisins og kynnir gæðaeftirlit (svo sem SEC, SDS-PAGE uppgötvun virkni osfrv.) Á lykilskrefum. Sum forrit þurfa einnig viðbótargreiningu (svo sem endotoxín uppgötvun og ákvörðun kjarnsýru leifar), svipað og „gæðatrygging“ (QA) hugtakið í lífeðlisfræðilegum iðnaði, það er að koma í veg fyrir galla með kerfisbundnum ferlum. Með því að móta leiðbeiningar um gæðaeftirlit og skýra sérstaka staðla fyrir prótein hvarfefni sem notuð eru í vísindarannsóknum er markmiðið að koma á strangari próteinhreinsunarviðmiðum fyrir fræðilegar rannsóknarstofur, auka áreiðanleika og endurtekningarhæfni tilraunagagna og brúa bilið milli grunnrannsókna og iðnaðarstaðla.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5