Himnutækni og skýring á bóluefni (Ⅰ)

Bóluefni koma úr ýmsum áttum, þar á meðal vefjaþykkni, bakteríufrumum, veiruögnum, próteinum og kjarnsýrum sem framleiddar eru af raðbrigðafrumum spendýra, ger- og skordýrafrumum.

Algengasta aðferðin við framleiðslu bóluefnis byggist á frumgerjunarferli sem fylgt er eftir með hreinsun. Bóluefnaframleiðsla er flókið ferli sem felur í sér mörg mismunandi skref og ferli. Það er mikilvægt að velja rétta hreinsunaraðferðina til að ná tilætluðum hreinleika lokaafurðarinnar. Skýring bóluefna er mikilvægt skref sem hefur veruleg áhrif á endurheimt vöru og síðari hreinsun í kjölfarið. Nokkrar aðferðir er hægt að nota til að skýra bóluefni. Val á söfnunaraðferð og búnaði fer eftir gerð rafhlöðunnar, eðli vörunnar sem safnað er og vinnsluvökvanum. Þessar aðferðir fela í sér himnusíun (örsíun, snertiflæðissíun), skilvindu og djúpsíun (venjuleg flæðissíun). Af langri reynslu er bóluefnisuppskeru skýring venjulega náð með skilvindu fylgt eftir með djúpsíun.

 

Undanfarin ár hafa tækni sem byggir á himnu rutt sér til rúms við skýringu á bóluefni. Uppstreymisferli nota í auknum mæli einnota tækni, þannig að uppskeruaðferðir verða að breytast. Þessi grein veitir yfirgripsmikið yfirlit yfir mismunandi tækni sem byggir á himnu og notkun þeirra til að skýra bóluefni.

 

01 Inngangur

Bóluefni eru mikilvægur þáttur í forvörnum okkar gegn smitsjúkdómum, sem eru enn átakanleg dánarorsök. Milli 2 og 3 milljónir manna bjargast frá barnaveiki, stífkrampa, kíghósta og mislingum á hverju ári þökk sé bólusetningu. Bóluefni spanna breitt svið, allt frá litlum raðbrigðapróteinum til heilu vírusagna og heilu baktería. Þau geta verið framleidd með mismunandi kerfum: eggjum, spendýrafrumum, bakteríum osfrv. Vegna margbreytileika og margbreytileika bóluefna er engin almenn hreinsunaraðferð eða sniðmát til, þrátt fyrir vaxandi áhuga á bóluefnispöllum.

 

Venjulega er hægt að skipta bóluefnisferli í þrjá hluta: andstreymis (framleiðsla og skýring), niðurstreymismeðferð (hreinsun þar á meðal ofsíun, litskiljun og efnameðferð) og samsetningu (lokafyllingaraðgerðir). Óháð framleiðslukerfinu gegnir skýring (fyrstu fjarlæging óæskilegra efna) lykilhlutverki við að ákvarða öflugt hreinsunarferli. Viðeigandi skýringarskref fjarlægir aðallega heilar frumur, frumurusl, kvoða og stóra fylliefni til að draga úr álagi af vinnslu í kjölfarið. Í sumum tilfellum getur skýring einnig dregið úr óleysanlegum óhreinindum, hýsilfrumupróteinum (HCP) og hýsilfrumukjarnsýrum. Eins og öll önnur hreinsunarskref þarf að fínstilla skýringarskrefið til að ná hámarksuppskeru og hreinleika afurða á sama tíma og aðlagast sérhæfni og framleiðsluþvingunum bóluefnisins.

 

Vegna ólíkra tegunda bóluefnis eru margvíslegar aðferðir notaðar til skýringar, þar á meðal skilvindu eða síun (tafla 1).

 

Venjulega er þörf á nokkrum röð aðgerða til að ná tilætluðum skýringum. Fyrri aðgerðin er hönnuð til að fjarlægja stærri agnir (aðalhreinsun) og seinni aðgerðin er hönnuð til að fjarlægja kvoða og aðrar undirmíkróna agnir (annarhreinsun). Lághraða skiljun þjónar sem einskiptis skýringarvalkostur, sem gerir kleift að fjarlægja frumur og frumurusl með úrkomu. Miðflótta þolir mikið fast álag og hefur verið mikið notað í lotu- eða samfelldri stillingu og skífuskilvindur. Það krefst mikils fjármagnsfjárfestingar og viðhaldskostnaðar og stendur frammi fyrir áskorunum við að stækka vegna skorts á áreiðanlegu módeli. Hins vegar nota sumir bóluefnaframleiðendur í atvinnuskyni skilvindur í stórum framleiðslu sem felur í sér mikið vinnslumagn og meiri framleiðslustarfsemi.

 

Skýringarsíun er hægt að framkvæma með venjulegri flæðissíun (NFF, einnig þekkt sem dead-end síun) eða snertiflæðissíun (TFF, einnig þekkt sem krossflæðissíun). Það eru líka til sérstakir síustillingar (djúpsíur) sem innihalda jákvætt hlaðin efni og sía AIDS sem eykur varðveislu frumurusa, kvoða og neikvætt hlaðna óæskilegra íhluta.

 

Himnusíur halda í agnir eftir stærðarútilokun og hafa ekki mikla óhreinindisgetu, svo þær eru hentugar fyrir auka skýringarþrep. Bæði djúpsíur og himnusíur eru auðvelt að skala og útfæra (einföld kerfishönnun). Ólíkt NFF er TFF aðallega notað til aðalskýringar (örsíun). Himna með afmörkunarsviðinu 0.1-0.65 μm (helst með opinni rás) hefur verið notað með góðum árangri til að halda í frumur, frumurusl og önnur stór mengunarefni. Flest TFF búnaður er línulega skalanlegur og endurnýtanlegur eftir hreinsun, sem dregur verulega úr kostnaði við rekstrarvörur fyrir þrepið.

 

Skýringarþrepið liggur á milli uppstreymis og niðurstreymisferlanna og er stundum gleymt við þróun bóluefnaferlisins vegna þess að tími og fjármagni er forgangsraðað fyrir önnur hreinsunarþrep, svo sem litskiljun eða þéttleikastigsskilvindu.

 

Jafnvel einkaleyfi fyrir bóluefnisframleiðsluferli sleppa oft skýringarskrefinu. Skýrandi skilvirkni hefur bein áhrif á frammistöðu niðurstreymisferlisins. Illa fínstillt skýringarskref getur haft neikvæð áhrif á getu dauðhreinsuðu síunnar eða getur stytt endingartíma litskiljunarplastefnisins. Í dag hafa strangari eftirlitsvæntingar tilhneigingu til að gera bóluefnisframleiðendur til að framleiða hreinni, vel einkennandi en hagkvæm bóluefni. Í þessu tilfelli þarf að gefa hverju skrefi þá athygli sem það á skilið. Núverandi þróun bendir til þess að uppstreymisferlið sé að færast í átt að „hreinna“ tjáningarkerfi (þ.e. frumur ræktaðar í sermilausum miðlum koma í stað egg) með aukinni framleiðni og meiri frumuþéttleika.

 

Verið er að einfalda og hagræða niðurstreymishreinsunarferla til að auka hreinleika lokaafurðarinnar. Til að takast á við þessar breytingar getur skýringarskrefið ekki orðið flöskuháls. Í þessu tilviki mætir síunartækni nýrri skýringaráskorun, þar sem fjallað er um aukinn sveigjanleika í ferlinu, möguleika á einnota notkun og minni fjárfestingarkostnað.

 

02 Skýring á veirubóluefnum

Nokkrar gerðir af skýringaraðferðum, annað hvort einar sér eða í sameiningu, hafa verið notaðar með góðum árangri til að skýra uppskeru í fóðurenda bóluefna.

Tilraunakvarði:1-20L, framleiðslukvarði: meira en 20L

 

2.1 Varúðarráðstafanir til að skýra veirubóluefni

Mörg bóluefni innihalda allar eða hluta veiruagnanna til að mynda ónæmi gegn veirusýkingu. Þeir falla almennt í fjóra víðtæka flokka:

Lifandi veiklað bóluefni (LAV), sem er byggt á veiktum stofni veirunnar til að draga úr meinvirkni hennar. Veiklaðar veirur geta fjölgað sér í líkamanum en eru ekki sjúkdómsvaldandi.

- Óvirkjað veiru (IV) bóluefni, sem innihalda efnafræðilega eða útfjólubláa óvirkjaða veirur til að útrýma smithættu. Veiruagnir geta verið heilar, skiptar eða hreinsaðar (aðeins mótefnavaka prótein).

- Veiruferjubóluefnið (VV) er virk, ekki sjúkdómsvaldandi veira sem sýnir mótefnavaka sjúkdómsvaldandi veiru. Þessi nýlega þróuðu mannvirki eru einnig notuð til genameðferðar.

Veirulíkar agnir (VLPs) bóluefni, sérstakur flokkur veiru undireiningabóluefna sem líkja eftir heildarbyggingu veiruagna en innihalda ekki smitandi erfðaefni.

 

Í flestum tilfellum eru veiruagnirnar alveg ósnortnar meðan á skýringarþrepinu stendur, jafnvel meðan á leysingu veirubóluefnisins stendur (klofnun fer venjulega fram aftan við, í hreinsaðra umhverfi).

Helsta áskorunin við veiruhreinsun er endurheimt veiruagna með mikilli afkastagetu á sama tíma og frumurusl, stórar agnir og óleysanleg aðskotaefni eru fjarlægð á skilvirkan hátt. Eins og lýst er í eftirfarandi köflum eru nokkrir þættir sem geta valdið niðurbroti eða tapi vírusa. Að auki getur verið erfitt að reiða sig á veiruávöxtun vegna mikils breytileika veirumagnsgreiningaraðferða á þessu stigi ferlisins, sérstaklega fyrir LAV og VV bóluefni. Fyrir þessi bóluefni er veiruávöxtun oft metin með sýkingarprófum eins og skelluprófi eða TCID 50 prófi. Sú staðreynd að sum af uppskeru efnasamböndunum geta truflað getu veirunnar til að sýkja vísbendingafrumur eykur breytileika þessarar megindlegu nálgunar.

 

2.2 Stefna til að skýra veirubóluefni

Veirubóluefni eru mjög mismunandi að stærð, uppbyggingu, lögun og tjáningarkerfum (tafla 3).

Fyrir vikið er almennt ekkert sniðmát fyrir ferla þess, sérstaklega skýringarskrefin. Fræðilega séð er hægt að velja allar tiltækar aðferðir (lághraða skiljun, örsíun TFF, NFF) og hugsanlega sameina til að skýra veiruna. Í raun er árangur skýringaraðferða undir áhrifum af tjáningarkerfinu og eðlisefnafræðilegum eiginleikum veiranna sem taka þátt.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} frumur /ml) skýringaraðferð, með því að nota katjónískar fjölliður, minnkaði djúpsíunarsvæðið um 4 sinnum miðað við hefðbundnar aðferðir. Þessi tækni gerir ráð fyrir uppskeru gerjunarefna með stórum afköstum án þess að nota skilvindur. Á sama hátt, Riske o.fl. sýndi að kítósanmeðferð á 40 L frumuræktun (0,02%) sem innihélt 1,4-2,6% fast efni leiddi til 7-faldrar aukningar á algerri síugetu eftir djúpsíun.

 

Þeir nefna einnig að kítósan virðist bæta skýringarvirkni með því að flokka undirmíkróna agnir, sem venjulega setjast í skilvindur. Líklegt er að formeðferð og flokkunaraðferðir verði áfram hluti af skýringum á síun bóluefnis í framtíðinni. Penetrants, þar á meðal sykur, glýkól og amínósýrur, flokka helst veirur. Veiruflokkun með osmótískri lausn á eftir 0.2µ örsíun er hægt að nota sem alhliða ferli til að hreinsa veirur. Penetrants geta örvað veirusamsöfnun með því að draga úr vökvalaginu í kringum agnirnar til að flokka vatnsfælin óhjúpaðar veiruagnir og hjúpaðar veiruagnir. Þrátt fyrir að sýnt hafi verið fram á að penetrants flokki veirur, hefur aðferðin tilhneigingu til að vera vettvangur fyrir framtíðarhreinsun bóluefnis og ekki hefur verið sannað að hún sé fýsileg í tilrauna- eða stórfelldum bóluefnahreinsun. Flokkunarformeðferðaraðferðin, sem líklegt er að verði áfram hluti af framtíðarhreinsun bóluefnissíu, er framkvæmd í 2L gerjunartæki. Til þess að hugsanlega sé hægt að nota þessar aðferðir í umfangsmiklum framleiðsluaðgerðum þarf að staðfesta þessar aðferðir á tilrauna- og framleiðslukvarða.

 

2.2.1 Að tjá kerfisáhrif

Skýringaraðferðin fer aðallega eftir tegund uppstreymisferlis og tjáningarkerfis, sem ákvarðar tegund og magn mengunarefna sem á að fjarlægja. Veirubóluefni eru venjulega framleidd í kjúklingafósturvísum með samfelldum frumulínu spendýra eða fugla eða bakúlóveiru/skordýrafrumum, sem eru flóknara tjáningarkerfi. Sumar tegundir VLP geta einnig verið framleiddar með öðrum ólíkum tjáningarkerfum (bakteríum, ger, plöntufrumum).

 

2.2.1.1 Veira framleidd í kjúklingafósturvísi

Bóluefni hafa verið framleidd í eggjum í áratugi. Þetta verk á rætur sínar að rekja til ársins 1931, þegar Woodruff og Good Pasture notuðu farsællega kóríó-allantó himnu frjósömra eggja sem undirlag fyrir veiruvöxt. Í dag eru mörg bóluefni fyrir menn og dýr enn framleidd með þessu forna ferli. Þekktust er líklega árstíðabundið inflúensubóluefni. Meginreglan er að sáð eru kjúklingaegg með áhugaverðum vírusum og endurtaka sig síðan í chorio-allantoic himnu. Eftir æxlun er allantoisvökvi ríkur af veiruögnum safnað og hreinsaður.

 

Allantoic vökvi er krefjandi skýringarfóður. Hátt steinefna- og próteininnihald þess (þar á meðal ovalbumin) gefur því mikla seigju. Allantoic vökvi inniheldur einnig nauðsynleg vefjasambönd úr kjúklingafósturvísum, svo sem fjaðrir, gogg, æðar eða blóðfrumur. Vegna mikils föstefnainnihalds er lághraða skiljun ákjósanlegasti kosturinn fyrir frumskýringu, sem venjulega leiðir til endurheimtarhlutfalls upp á um 70%. Hins vegar er aðal skýring með síunaraðferðum einnig möguleg. Fyrir NFF hafa pólýprópýlen og sellulósa-undirstaða djúpsíur góða söfnunargetu allantoic vökva. Yfirborðssíur úr pólýprópýleni eða sellulósa-byggðum djúpum síum geta haft afkastagetu upp á 150-210 L/m² og dregið úr gruggi fóðurflæðis um allt að 3 sinnum. TFF tækið fyrir opna fóðurrás hentar einnig vel til hreinsunar á þanbilsvökva þar sem tækið hentar betur fyrir lágmarksþrýstingstap í gegnum fóðurrásina og dregur þannig úr rásstíflu.

 

Auka skýringarskrefið er auðvelt að gera með NFF. Sambland af pólýprópýleni, sellulósa og glertrefjaefnum sýnir almennt góða skilvirkni og valkostur við auka skýringarskrefið er að nota TFF og {{0}}}.65μm eða 0.45μm örsíunarhimnutæki og stjórna osmótískt flæði stjórna. TFF tæki með opnum rásum með vatnssækinni PVDF eða vatnssækinni PES himnu er hægt að nota í þessu skrefi.

Mikilvægt er að hafa í huga að veiruagnir geta tengst óleysanlegu rusli, sem getur dregið verulega úr veiruframleiðslu meðan á skýringu stendur. Notkun saltlausnar getur dregið úr þessum tengslum milli inflúensuveira og fastra hluta, sem leiðir til um það bil tvöfaldrar framleiðslu án þess að hafa áhrif á heilleika veiruagnanna.

 

2.2.1.2 Veirur framleiddar í spendýra- og fuglafrumulínum í röð

Nýlega hafa sum veirubóluefni fjarlægst ferli sem byggir á eggjum í þágu frumuræktunarferla (sérstaklega fyrir inflúensubóluefni). Aðalástæðan fyrir þessum breytingum er að koma í veg fyrir bóluefnisframleiðsluvandamál sem tengjast eggjum úr fósturvísi (þ.e. skortur á eggjabirgðum sem getur komið upp ef einhver alifuglasjúkdómur kemur upp). Fyrir vikið eru margar tegundir bóluefna og veiruferja þróaðar með því að nota samfelldar frumulínur úr spendýrum eða fuglum, hefðbundnar frumulínur (eins og Vero, MDCK eða HEK293 frumulínur) eða sérfrumulínur.

 

Það fer eftir tjáningarkerfinu, vírusinn getur verið inni í frumunni, sem þarfnast frumulýsingarþreps, eða hún getur verið utan frumunnar (lýs eða verðandi). Fasta hleðslan og leysanlegt innihald sem fæst úr frumuræktun eru mun hreinni en allantoic vökvafasinn. Fyrir vikið er NFF tækni auðveldari í framkvæmd og afkastagetan er umtalsvert meiri. Hins vegar er síunargeta mjög háð frumuræktunarskilyrðum, svo sem frumuþéttleika eða lífvænleika frumna við uppskeru. Þessar breytur hafa áhrif á magn frumurusa og stórsamlagna sem geta stíflað djúpar síur og himnur, sem leiðir til minni afkastagetu.

 

Thomassen o.fl. gefa gott dæmi um skýringar NFF. Notað í framleiðsluferli óvirkjaðs mænusóttarveiru (IPV). Vero frumur ræktaðar á örberum voru notaðar til veirufjölgunar með frumuþéttleika upp á {{0}}.78 x 106 frumur /ml TOI. 75μm ryðfríu stáli skjár er notaður til að forskýra til að fjarlægja örbera úr uppskerunni. Tveggja laga flokkunin er skýrð með þéttleika djúpsíu (0.2-2.0μm), fylgt eftir með dauðhreinsaðri síu.

Valin stigstæranleg einnota eining var notuð með góðum árangri til að framleiða Sabin IPV klínískt prófunarefni á 350 L mælikvarða. Það fer eftir sermisgerð veirunnar, endurheimtarhlutfall vírusa er 86 til 96 prósent.

 

2.2.1.3 Baculovirus/veirulíkar agnir framleiddar í skordýrafrumukerfinu

Hugleiðing bakúlóveiru/skordýrafrumukerfa fyrir stórfellda bóluefnaframleiðslu er tiltölulega ný, en vekur aukinn áhuga á sviði veiruferja og VLPs. Helsti ávinningur þessa kerfis er að það felur í sér skammtíma (engin þörf á að koma á frumulínum) og öruggri (engin fullkomið veiru DNA) framleiðslu. Það eru líka nokkrir ókostir, svo sem þörf á að fjarlægja bakúlóveiru og stöðugleika vörunnar.

 

Cervarix, VLP bóluefni gegn papillomaveirusýkingu úr mönnum, framleitt af GlaxoSmithKline, er fyrsta bóluefnið fyrir menn sem er framleitt í atvinnuskyni í skordýrafrumum. Fjöldi bóluefna sem byggja á VLP og rAAV ferjurum sem framleiddar eru í bakúlóveiru-sýktum skordýrafrumum eru nú í þróun. Skordýrafrumulínur unnar úr haustherormum Spodoptera frugiperda (Sf9 og Sf21) og kálbeygjuormi Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 frumum) eru algengastar vegna getu þeirra til að vaxa í sviflausn, sem einfaldar mögnun andstreymis. ferli. Eftir að hafa vaxið í æskilegan þéttleika lifandi frumna, eru þessar frumur sýktar af raðbrigða bakúlóveiru í veldisvísisfrumuvaxtarfasa fyrir próteintjáningu. Hið stóra erfðamengi bakúlóveira gerir kleift að tjá fimm eða fleiri mismunandi prótein, sem passar við margbreytileika VLP og veiruferja.

 

Bernard o.fl. lýsti niðurstreymisferli skordýrafrumuræktunar. Ferlið er mjög breytilegt og endurspeglar fjölbreytileika próteina sem framleidd eru með þessari tækni. Fyrsta skrefið í hreinsunarröðinni er undir miklum áhrifum af rúmmálseiginleikum lífreactorsins (þ.e. frumuþéttleika og lífvænleika), eða eðli losunar vörunnar (skilið út með verðandi eða frumulýsi). Baculovirus sýking í skordýrafrumum getur valdið frumuleysi innan 3-5 daga. Eyðing frumna getur leitt til aukningar á próteinlýsuvirkni og öðrum umhverfisþáttum sem geta leitt til niðurbrots raðbrigða próteina.

Reynt hefur verið að þróa bakúlóveirur með minni getu til að koma frumulýsi af stað. Baculoveiran leysir minna en 10 prósent af sýktum skordýrum.

 

Frumugreiningu er hægt að framkvæma með mismunandi aðferðum, svo sem frostþíðingu, þvottaefni, einsleitarefnum eða ómskoðun. Skordýrafrumur hafa engan frumuvegg og leysast því fljótt upp. Þrátt fyrir að tilkynnt hafi verið um ultrasonic meðferð í mörgum bekkurferlum, er það sjaldan notað á tilrauna- eða viðskiptalegum mælikvarða. Algengasta aðferðin er að nota einsleitara til að eyða frumum í návist lágstyrks þvottaefnis (0.1% Triton X-100 eða NP-40). Notkun þvottaefna og örvökvunar eða einsleitni með osmósuáhrifum hefur verið beitt með góðum árangri í mörgum stórum framleiðsluferlum. Venjulega eru skordýrafrumur sviflausnar í lýsisjafna (50 mM TRIS pH7,7, 300 mM NaCl, 5% glýseról, 0,2 mM PMSF og próteasahemlar), þar sem Triton-X100 er bætt við í 0,1% lokastyrk, fylgt eftir með vægri ómskoðun eða örvökva. Blandan er síðan skilin í skilvindu til að fjarlægja óleysanlegar agnir.

 

Á þessu stigi getur lýsatið virst mjög skýjað og erfitt er að sía það með því að nota 0.45μm síu. Stundum er hægt að sjá allt að 30% tap á meðan á hitahreinsunarskrefinu stendur. Að bæta við bensóensímum á klofningsstigi hjálpar til við að leysa síunarvandamálið. Hreinsun frumanna með fosfatbúðuðum saltvatni eftir uppskeru og hraðri „frystingu-þíðingu“ í miklu salti (500mM NaCl) sem inniheldur sprungubuffið hjálpar til við að fjarlægja fyllingarnar.

 

Skýring á VLP og veiruferjum sem skordýrafrumur framleiðir á sér stað eftir frumugreiningu (með efnafræðilegri eða vélrænni meðferð), sem losar ekki aðeins veiruagnir heldur einnig mikið magn af frumukjarnsýru. Skordýrafrumur geta vaxið við mikinn frumuþéttleika, frá 1-9.10 6 frumum/ml. Þess vegna ætti skýringarskrefið að fjalla um mikinn frumuþéttleika, hátt kjarnsýruinnihald og, ef mögulegt er, fjarlægja bakúlóveiruagnir. Til að gera málið flóknara geta VLPs eða veiruferjur og bakúlóveir verið svipaðar stærðir (bakteríur eru 60-80 nanómetrar á breidd og 300-400 nanómetrar að lengd). Vegna mikils frumuþéttleika hefur skilvindu verið ákjósanlegasta aðferðin við frumskýringu í áratugi. Hins vegar virðast himnuferli vera mjög aðlaðandi valkostur vegna þess að auðvelt er að skilgreina sveigjanleika.

 

Djúpsíur hafa verið notaðar á áhrifaríkan hátt í niðurstreymisferli þriggja laga rótaveirulíkra agna. Á rannsóknarstofustigi er CsCl þéttleikahalli útskilvinduaðferðin oft notuð til að hreinsa þessar flóknu agnir. Rannsakendur mátu ekki aðeins skýringarþrep djúpsíunnar, heldur einnig allt niðurstreymisferlið (Triton X-100 klofning og djúpsíun, fylgt eftir með ofsíun og útilokun kornastærðar). Niðurstöðurnar sýna að afrakstur CsCl þéttleikahallans getur náð 37%.

Ofur-miðflóttaaðferðin er um 10%. Sem annað dæmi voru 0,45μm holar trefjar og 500 kDa trefjar með fínum þvermál notaðir til að endurheimta og þétta HIV-líkar agnir sem framleiddar eru í skordýrafrumum. Í þessari rannsókn var skurðkraftur holra trefja fínstilltur út frá heilleika frumunnar. Niðurstöður Lágt skúfkraftsferli var komið í staðinn fyrir útskiljun á borðsykri.

 

Ferlið hefur möguleika á að nota til fjöldaframleiðslu. Djúpsíur hafa einnig verið notaðar með góðum árangri við framleiðslu á raðbrigðum kirtilstengdum vírusum. Frumugreining var gerð með tveggja stimpla vélrænni frumujasara, fylgt eftir með nukleasameðferð. Í skýringarskrefinu var 1,2μm glertrefjadjúpsíuhlutur notaður, fylgt eftir með tveimur lögum af 0.8μm vatnssæknum PES og 0.2μm vatnssæknum PES. Hlutfallsstærðar síur eru notaðar fyrir vinnslulotur frá minni til 200 L stærðum. Djúpsíur hafa verið notaðar með góðum árangri og einnig hefur verið greint frá því að TFF einkunnir með flötum filmum eða holum trefjum upp á 0,2µm eða 0,45µm hafi verið mjög áhrifaríkar.

 

Rannsókn Tecnologica (IBET) við Oeiras Institute of Experimental Biology í Portúgal notaði NFF til að gera útskýringu á lifrarbólgu C VLP sem tjáð er af baculoveirum án skilvindu. Pólýprópýlen síur með nafnvirði (10,5,0.6 og 0.3μm) síur eru notaðar til að skýra VLP uppskeru. Sömu síur með 0.6μm og 0.3μm pore einkunnir eru notaðar fyrir síun í VLP uppskerustöðvum. Allar síuvökvar sem rannsakaðar voru voru prófaðar með tilliti til endurheimtarhraða HCV-VLP og ráðlagðar síunaraðferðir bornar saman. Niðurstöðurnar eru sýndar í töflu 4.

Niðurstöðurnar sýndu að 5μm-0.3μm sían hafði mesta vöruendurheimtuna (100%) fyrir beint uppskera lifrarbólgu C VLP fóður. Pólýprópýlen 0,6μm sían var með mesta vöruendurheimtuna (82%) fyrir miðfóðrið og DNA úthreinsun hýsilfrumunnar var um 70%.

 

2.2.1.4 Veirulíkar agnir framleiddar í bakteríu- eða gerkerfum

Tegund skýringaraðferðar fyrir VLP bóluefni tjáð í bakteríu- eða gerkerfum fer eftir losun VLP til utanfrumumiðlara. Ef ekki er hægt að seytt VLPs á skilvirkan hátt, gæti frumulýs eða önnur útdráttarskref verið nauðsynleg fyrir raunverulegt skýringarskref. Þó að þetta sé gulls ígildi í próteinhreinsunariðnaðinum, skilvindu (samfelld eða lotu) tjáð í kerfum eða ger sem byggir á kerfum, hafa himnuferli nýlega orðið mjög aðlaðandi valkostur vegna auðveldrar sveigjanleika og samhæfni við einnota. meðferðir.

 

Richter og Topell útskýra notkun skilvindu, TFF, eða blöndu af hvoru tveggja við undirbúning VLPs framleidd í skýrum E. coli. Í vinnu þeirra voru 0.45m TFF himnur notaðar til að þynna og skýra einsleitu E. coli einsleitu efnin við 5 gráðu hita. Þeir taka einnig fram að himnubundið TFF hentar til að meðhöndla uppskeru með mikilli seigju, helst með því að nota TFF einingar með opnum rásum.

Miðflóttaskýring hefur einnig verið metin sem valkostur við TFF. Í þessu tilviki var einsleita efnið sem myndast ekki þynnt og skilið í skilvindu við 4 gráður í 105 mínútur, 10000g. Án þess að flytja mjúku húðina var flotinu hellt úr agnunum og skilið aftur í skilvindu við 4 gráður og 10.000 g í 60 mín. Fljótandi vökvinn var síðan fjarlægður úr núverandi ögnum, þynnt með EB jafnalausn (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 og síaður á 0,22 m dauðhreinsuðu síutæki. Frekari vinnsla. Uppbyggingarferlið fyrir framleiðslu á þessu VLP bóluefni í E. coli á 800L mælikvarða var einnig skýrt með samsetningu skilvindu og TFF.

 

Raðbrigða lifrarbólgu E bóluefnið HEV 239 hefur fengið leyfi í Kína til að bólusetja fullorðna 16 ára og eldri. Bólumótefnavakar (VLP) eru tjáðir í E. coli og sýnt hefur verið fram á að uppbygging á mótefnavakaframleiðsluferlinu sé á 50L mælikvarða. Varan var dregin út með því að sprunga E. coli og innilokunarhlutarnir voru aðskildir frá frumubrotunum með þungum þvotti með stuðpúða sem innihélt 2% Triton X-100 og síðan leyst upp með 4 M þvagefnisjafnara. TFF skýrir manna papillomavirus VLP framleitt í Saccharomyces cerevisiae (15L). Frumulýsatið sem var meðhöndlað með núkleasa var hreinsað með krossflæðis örsíun í gegnumsíunarham með því að nota 0,65 μm holtrefjasíu. Sama ferli er notað við framleiðslu bóluefna. Þó að aðeins örfá VLP-undirstaða bóluefni hafi náð viðskiptalegum mælikvarða, eru nokkur VLP-undirstaða bóluefni í þróun, flest þeirra eru skýrð með skilvindu eða himnutækni.

 

Takmörkuð af áhrifum rýmis munum við deila seinni hluta efnisins í næsta kafla. Í næstu grein munum við deila nokkrum tilvikum um skýringu á bóluefni og notkun viðeigandi himnuhluta.

 

Sem fyrsta fyrirtækið í staðsetningarrásinni hefur Guidling Technology safnað nægilega viðeigandi reynslu af skýringu bóluefna. Guidling Technology er þróunar- og framleiðslufyrirtæki með áherslu á líflyfja- og frumurækt, hreinsun og aðskilnað. Vörur eru mikið notaðar í líflæknisfræði, greiningu, iðnaðarvökvasíun, uppgötvun, skýringu, hreinsun og einbeitingarferli; Guidling hefur með góðum árangri þróað ofursíunarskilvindurör, ofsíunar/örsíunarhimnuhylki, víruseyðingarsíu, snertiflæðissíubúnað, djúpan himnustafla osfrv., sem uppfylla að fullu notkunarsviðsmyndir líflyfja og frumuræktunar.

 

Himnur okkar og himnusíur eru mikið notaðar við styrk, útdrátt og aðskilnað forsíunar, örsíunar, ofsíunar og nanósíunar. Fjölbreytt úrval vörulína okkar, allt frá lítilli einnota rannsóknarstofusíun til framleiðslusíunarkerfa, ófrjósemisprófunar, gerjunar, frumuræktunar og fleira, getur mætt þörfum prófunar og framleiðslu.